CONTOH JURNAL ISOLASI DNA GENOM TUMBUHAN PEPAYA (Carica papaya) DAN ELEKTROFORESIS DENGAN GEL AGAROSA
ISOLASI
DNA GENOM TUMBUHAN PEPAYA (Carica papaya)
DAN ELEKTROFORESIS DENGAN GEL AGAROSA
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perkembangan
biologi molekuler yang pesat sejak akhir abad ke-20 ikut mendukung
berkembangnya penelitian penelitian di bidang biologi termasuk biodiversitas
dan sistematika tumbuhan. Penggunaan penanda molekuler misalnya. Penggunaan penanda
molekuler memiliki beberapa keuntungan, yaitu hasil yang konsisten dan dapat
dideteksi pada semua jenis jaringan dengan berbagai tahap perkembangan, serta
tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Penelitian biodiversitas dan
sistematika tumbuhan yang menggunakan analisis dengan penanda molekuler diawali
dari ekstraksi DNA. Sampel untuk ekstraksi DNA tumbuhan dapat berasal dari
berbagai sumber, seperti jaringan segar (Herrmann dan Hummel, 1994).
DNA menyimpan informasi penting tentang struktur hewan atau tumbuhan, dan membantu langsung organisme seperti tumbuh dan mengelola tugas-tugas sehari-hari. Kromosom berfungsi sebagai penyimpanan untuk bahan penting ini, secara berkala membagi bersama dengan sel dan mereplikasi untuk membuat salinan DNA yang
dikandungnya. Kromosom juga sangat penting dalam reproduksi seksual, karena mereka memungkinkan organisme untuk menyampaikan materi genetik pada keturunan. Dalam organisme dengan inti sel, yang dikenal sebagai eukariotik, kromosom ditemukan dalam nukleus. Sebagian besar organisme memiliki satu sel. Kromosom juga sangat penting dalam reproduksi seksual, karena mereka memungkinkan organisme untuk menyampaikan materi genetik pada keturunan. Dalam organisme dengan inti sel, yang dikenal sebagai eukariotik, kromosom ditemukan dalam nukleus (Lini, 2008).
Isolasi
DNA genom adalah langkah pertama dalam kebanyakan percobaan biologi molekuler.
Faktor yang menentukan kapan memilih metode ekstraksi adalah kuantitas, kualitas dan kemurnian
DNA yang terisolasi. Teknik biologi molekuler membutuhkan DNA dari berbagai
kemurnian dan kualitas. Saat ini, ada banyak metodologi dan isolasi untuk
ekstraksi DNA genom dengan menggunakan properti yang optimal (Stefunoval et al., 2013).
1.2
Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum ini adalah:
a. Mengetahui tahapan dan prinsip isolasi DNA genom dari tumbuhan secara sederhana.
b.
Mengetahui cara
membuat gel agarosa.
c.
Mendeteksi DNA pada
gel agarosa.
1.3 Manfaat Praktikum
Manfaat dari praktikum ini adalah:
a.
Dapat mengetahui tahapan dan prinsip isolasi DNA genom dari tumbuhan secara sederhana.
b. Dapat Mengetahui cara membuat gel agarosa.
c. Dapat Mendeteksi DNA pada gel agarosa.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 DNA
Kromosom manusia yang berjumlah
23 pasang, mengandung ribuan
gen yang merupakan rantai pendek dari DNA yang membawa kode informasi tertentu dan spesifik untuk satu macam polipeptida yang harus disintesa oleh sel. Genom manusia merupakan susunan dari DNA pada semua kromosom dengan panjang total (haploid)
sekitar 3 juta kb (3.000 Mb). Pada 46 buah kromosom, jumlah pasangan basa pada sekitar 6 x 109
pasangan basa
DNA. Perkiraan terakhir jumlah gen pada manusia berdasarkan pada Human Genome Sequences yang
dikeluarkan oleh Celera Genomics dan Human Genome Project (2001)
adalah sekitar
26.000 - 40.000. Jumlah DNA bervariasi dari satu kromosom ke kromosom yang lain.
Paling panjang adalah kromosom dengan jumlah sekitar 263 Mb dan
paling pendek adalah kromsom no. 21 sekitar
50 Mb. Genom berpotensi mengalami mutasi yaitu perubahan pada kromosom, gen dan DNA.
DNA merupakan sepasang rantai/untai panjang polinukliotida berbentuk spiral ganda
(double helix) yang dihubungkan dengan ikatan hidrogen dan berdiameter sekitar 2 nm. Sebuah nukliotida tersusun dari molekul gula, basa dan gugus fosfat. Empat jenis basa nitrogen yang
terikat pada molekul gula dan saling berpasangan adalaha denin (A) dengan timin (T) melalaui ikatan ganda hidrogen, dan guanin (G) dengan sitosin (C) melalui ikatan tiga hidrogen. Dengan adanya ikatan antara dua untai polinukliotida ini, maka tiap untai DNA adalah komplementer dengan untai DNA lainnya (Alatas, 2006).
Sebagian besar organisme memiliki satu sel kromosom yang datang berpasangan. Pada sel struktural, setiap sel mempertahankan satu set lengkap kromosom, dalam apa yang dikenal sebagai bentuk diploid, mengacu pada fakta bahwa sel kromosom lengkap. Proses kehidupan merupakan suatu proses
metabolisme yang berlangsung di dalam sel. Penentuan sifat organisme dilakukan oleh gen melalui pengendalian proses metabolisme dengan cara mengatur reaksi-reaksi kimia yang menyusun suatu lintasan metabolisme. Proses metabolisme merupakan rangkaian dari jutaan reaksi kimia (Lini, 2008).
2.3 Fungsi DNA
Analisis sitogenetika khusus
sifat-sifat morfologi kromosom (bentuk dan ukuran) dapat menghasilkan informasi
susunan kromosom (kariotipe). Informasi genetik ini berguna untuk pengembangan
tanaman khususnya berkaitan dengan kegiatan pemuliaan tanaman baik penerapan
secara langsung maupun tidak. Penggunaan informasi genetik dalam pemuliaan tanaman secara tidak langsung
yaitu berupa peningkatan pengetahuan susunan genetik suatu jenis tanaman dan
secara langsung berupa penerapan teknik sitogenetika untuk perbaikan sifat
tanaman. Terdapat tanaman yang memiliki kekhasan tersendiri. Kekhasan buah
terdapat pada warna buah, ukuran, rasa yang manis segar. Informasi genetika
tanaman belum banyak diketahui. Informasi genetika berkaitan erat dengan
kromosom sebagai komponen pembawa sifat genetik. Informasi tenang sifat-sifat
morfologi kromosom (bentuk dan ukuran) dan susunan kromosom (kariotipe) tanaman
(Sarasmiyarti, 2008).
Fungsi DNA dalam intisel adalah untuk mengendalikan faktor-faktor keturunan (proses
pewarisan) dan sintesa
protein yang terkait dengan peranan penting nya dalam mengatur aktivitas sel. Sebagai pembawa informasi genetik, DNA berperan dalam penyimpanan, replikasi,
rekombinasi dan penghantaran informasi penyimpanan,
replikasi, rekombinasi dan penghantaran informasi genetik. Dalam setiap molekul DNA urutan nukleotida sudah baku
karena urutan ini merupakan isyarat bagi normalnya informasi genetik. Urutan
dari pasangan basa pada untai DNA mengandung informasi genetik dalam bentuk
kode yang menyandi sejumlah besar protein yang ada dalam sel
(Alatas, 2006).
2.4 Kerusakan DNA
Paparan radiasi dapat
menimbulkan kerusakan baik pada tingkat molekuler, seluler ataupun
jaringan/organ. Dosis radiasi harus mencapai tingkat ambang tertentu untuk
dapat menimbulkan kerusakan akut, tetapi tidak sama halnya dengan kerusakan
geneik atau induksi kanker. Secara teori, dosis radiasi sangat rendah sudah
cukup untuk menimbulkan kerusakan, berarti bahwa tidak ada tingkat dosis yang
berbahaya secara homogen. Bahkan pada dosis yang relatif lebih tinggi tidak
setiap orang mengalami tingkat kerusakan yang karena adanya perbedaan tingkat
kemampuan dan ketepatan mekanisme perbaikan terhadap kerusakan yang timbul
akibat radiasi. Mutasi yang terjadi secara alamiah ataupun spontan pasa sel
somatik dan germinal masing-masing memberikan kontribusi pada induksi kanker
dan penyaki genetik yang diwariskan
(yaitu penyakit herediter). Kerusakan yang terjadi dapat diperbaiki tanpa
kesalahan sehingga struktur DNA kembali seperti semula dan tidak menimbulkan
perubahan fungsi pada sel. Tetapi dalam kondisi tertentu, proses perbaikan
tidak berjalan sebagaimana mestinya sehingga walaupun kerusakan dapat
diperbaiki tetapi tidak tepat ataupun sempurna sehingga menghasilkan DNA dengan
struktur yang berbeda, yang dikenal dengan mutasi. Sebuah mutasi genetik
berpotensi untuk menimbulkan perubahan yang dapat diamati pada generasi
berikutnya (Alatas, 2006).
Pada
dekade terakhir telah dijumpai banyaknya
penemuan tentang penggunaan radiasi khususnya sinar gamma, untuk evolusi
varietas unggul tanaman pertanian dalam bidang ekonomi. Misalnya dalam usaha
pemuliaan tanaman dengan induksi mutasi dengan mengguanakan iradiasi sinar
gamma. Induksi iradiasi dengan sinar gamma memberikan pengaruh yang berbeda
antara tanaman. Perbedaan tersebut dipengaruhi oleh tingkat radiosensitifitas
masing-masing tanaman selain perbedaan tingkat radiosensitifitas, pengaruh
iradiasi pada suatu jenis tanamn juga tergantung pada tingginya dosis iradiasi
yang diberikan. Dosis iradiasi pada tanaman menyebabkan terganggunya
kesimbangan hormon dan aktifitas enzim pada tanaman. Sinar gamma menyebabkan
adanya bentuk-bentuk mutasi pada tanaman yang terlihat dan di kelompokkan pada
tinggi tanaman, modifikasi atau abnormalitas daun, variasi cabang, mutasi pada
bunga, polong dan biji, menyebabkan kelainan pada tahap-tahap pembelahan
mitosis. Salah satu penyebab terjadinya perubahan fenotip adalah adanya
kelainan pada saat pembelahan sel baik pada saat mitosis maupun meosis. Pada
saat pembelahan sel kromosom sangat sensitif terhadap mutagen, sehingga akan
mudah mengalami kerusakan, kromosom alan lebih sensitif pada tahap profase saat
pembelahan mitosis (Palupi, 2015).
2.4 Isolasi DNA
Isolasi
DNA genomik berkualitas tinggi sering merupakan langkah awal untuk analisis
genetika molekuler dan sangat penting untuk banyak aplikasi dalam penelitian
molekuler. Kriteria untuk kualitas DNA adalah kemurnian, stabilitas dan
integritas dan ukuran molekul. Kuantitas juga sering merupakan masalah penting,
terutama untuk materi dengan sumber daya terbatas. Mungkin ada banyak protokol
dan teknik isolasi DNA yang tersedia. Namun hanya beberapa protokol yang
memenuhi kriteria yang disebutkan di atas, meskipun umumnya mereka bekerja berdasarkan
prinsip yang sama. Kit isolasi DNA komersial umum sangat tersedia, mengubur DNA
pada matriks afinitas. Kit ini mahal dan sulit untuk beradaptasi dengan
berbagai jumlah bahan awal, tetapi memungkinkan standarisasi lengkap, keluaran
tinggi dan otomatisasi. Protokol yang dijelaskan dalam bab ini memungkinkan
isolasi DNA dengan kualitas dan kemurnian yang sangat tinggi dalam waktu yang
wajar dan tanpa menggunakan bahan yang mahal atau langka. Protocol dapat dengan
mudah diadaptasi untuk aplikasi berskala besar dan menghasilkan DNA berkualitas
baik bahkan dengan sejumlah kecil bahan sampel dengan sedikit atau tanpa
kontaminan protein (Doolan, 2002).
Ada
banyak kesulitan yang terkait dengan isolasi asam nukleat tanaman yang
tidak terdegradasi yang bebas dari kontaminasi protein dan polisakarida.
Metode ekstraksi yang berbeda diperlukan karena kelompok tanaman yang
berbeda diperlukan karena kelompok tanaman yang
berbeda mengandung beragam senyawa sekunder
yang dapat mengganggu isolasi. Titik eksperimental utama yang
paling banyak disetujui oleh referensi adalah kebanyakan sel tumbuhan memilki dinding sel yang
sangat keras, oleh karena itu metode yang
kuat diperlukan untuk menghancurkan sel-sel yang
terbuka. Efisiensi dari kekuatan fisik yang
diberikan pada jaringan sangat penting
(Croy, 1993).
Lapisan atas pada cairan di pindahkan ke mikrotube baru
dan ditambahkan isopropanol dengan volume yang sama, aduan ini diinkubasi pada
suhu kamar selama 10 menit dan kemudian disentrifuge pada 15000 rpm selama 10
menit. Pellet DNA yang dihasilkan balik dengan etanol 70% dan kemudian dikering.dikultur dan untuk memperoleh kualitas DNA template yang baik. Dalam amplifikasi dengan PCR diperlukan kualitas DNA template yang
baik dan program yang sesuai. Sedangkan oleh karena bakteri CVPD masih belum bias dikultur tidak Memungkinkan untuk mengisolasi DNAnya saja, jadi dilakukan pendekatan dengan isolasi DNA total tanaman
yang diinginkan untuk dideteksi (Julyasih, 2014).
2.5 Elektroforesis
Banyak
pendekatan yang digunakan untuk mempelajari molekul-molekul DNA melibatkan
elektroforesis gel (gel electrophoresis).
Teknik ini menggunakan gel dari polimer, misalnya polisakarida. Gel bekerja
sebagai penapis molekul untuk memisahkan asam nukleat atau protein berdasarkan
ukuran, muatan listrik dan sifat-sifat lain. Karena mengandung muatan negatif
pada gugus-gugus fosfatnya, molekul asam nukleat bergerak ke arah kutup positif
dalam medan listrik. Saat bergerak kisi-kisi serat polimer menjadikan molekul
panjang lebih sulit bergerakdari pada molekul pendek, sehingga molekul-molekul
terpisah berdasarkan panjang. Dengan demikian, elektroforesis gel memisahkan campuran
molekul DNA lurus menjadi pita-pita, yang masing-masing terdiri atas
molekul-molekul DNA yang panjangnya sama. Satu lagi aplikasi yang bermanfaat
dari teknik ini adalah analisis fragmen restriksi (restriction fragment analysis), yang dapat dengan cepat menyediakan
informasi berguna tentang skuens DNA. Dalam tipe analisis ini, fragmen DNA yang
dihasilkan melalui digesti molekul DNA oleh enzim restriksi (pemotong)
dipilah-pilah dengan elektroforesis gel. Ketika campuran fragmen restriksi
menjalani elektroforesis, campuran itu menghasilkan pola pita yang khas untuk
molekul awal dan enzim restriksi yang digunakan (Campbell dkk, 2008).
Dalam urutan untuk mendapatkan
jawabannya, perlu mengisolasi DNA fragmen-fragmen
yang berisi serangkaian rangkaian yang pasti melalui hibridisasi berulang. Protokol hibridisasi
preparatif juga akan memfasilitasi pemurnian urutan genomik yang ditentukan
dan primer transkrip
mRNA untuk studi modifikasi asam nukleat, dan untuk analisis
protein tambahan. Satu keuntungan dari hibridisasi berulang dalam konteks ini
adalah bahwa hal itu meningkatkan kekhususan
keseluruhan pemurnian (Halpin and Harbury, 2004).
Dalam elektroforasi (electroporation),
sengatan listrik sejenak yang diberikan pada larutan yang mengandung sel akan
menciptakan lubang-lubang sementara pada membran plasma sel, yang dapat dilewati
DNA saat memasuki sel. Elektoforesis gel digunakan untuk memisahkan asam
nukleat atau protein yang memiliki bperbedaan ukuran, muatan listrik, atau
sifat-sifat fisik yang lain. Molekul DNA dipisahkan oleh elektroforesis gel
dalam analisis fragmen. Elektroforesis gel memisahkan molekul berdasarkan laju
pergerakannya (Campbell dkk, 2008).
BAB 3
BAHAN
DAN METODE
3.1. Waktu
dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan
pada hari Rabu, 04 April 2018 pada pukul 14.00
WIB sampai dengan selesai, dan dilanjutkan pada hari Jumat, 13 April 2018 pada
pukul 14.00 WIB sampai dengan selesai di Laboratorium Genetika dan Molekuler,
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sumatera Utara, Medan.
3.2. Alat dan
Bahan
Adapun alat yang digunakan
pada praktikum ini beaker glass,
pisau, pengaduk, kertas saring, plastik klep, spatula, gelas ukur, petridish,
mortal, pistil, dan alat sentrifuges, Hot Plate atau alat pemanas, alat waterbath, alat elektroforesis,
Erlenmeyer, mikropipet dan tipnya, gel doc (1 set). Sedangkan bahan yang
digunakan adalah Detergen bubuk, Detergen cair, akuades, garam dapur, etanol
absolut, alkohol 70 %, TAE (Tris Acetat
EDTA) IX, DNA marker misalnya 1 kb Ladder
Agarose 0,8%, kertas parafilm, larutan Etidium
Bromid (etBr), sterofoam, loading dye, ddH2O, Fragraria vesca, Manilkara zapota, Hylocereus polyrhyzus, Actinida
deliosa, Vitis vinivera, Ananas squamosa, Anona muricata, Dimocarpus longan,
Citrulus vulgaris, Carica papaya.
3.3. Prosedur Percobaan
3.3.1. Isolasi DNA Genom Tumbuhan
Dilarutkan sebanyak 4 spatula garam dapur
dalam 100 ml aquadest dalam beaker glass, Dimasukkan detergent sebanyak 5 gr.
Dihomogenkan, jangan sampai berbusa. Ditimbang 100 gr buah, tambah 20 ml
aquadest ke buah dan dihancurkan. Diambil 10 ml sampel dan ditambahkan 20 ml
larutan ekstraksi. Dipanaskan selama 10 menit dengan suhu 650 C pada
waterbath. Disaring, diambil 5 ml
sampel dan dimasukkan ke dalam petridis. Ditambahkan 1 ml isoamil alkohol. Ditambahkan 5 ml etanol
dingin secara perlahan tanpa terputus. Diamati perubahannya, dimasukkan
benang-benang ke dalam mikrotube. Diamkan selama 12 jam atau semalaman. Disentrifuse
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Kemudian dibuang supernatan.
Ditambah alkohol 70%. Disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
Dibuang supernatan. Kering anginkan, dan ditambah ddH2O, kemudian dilarutkan.
3.3.2. Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA
Pengujian
kualitatif dan kuantitatif DNA total diakukan dengan elektroforesis pada gel
agarose dengan konsentrasi 1 % dan nanofotometer (IMPLEN P-360 Nanofotometer P-Class) dengan panjang gelombang 260 nm
kemudian DNA dihitung kemurnianya dengan perbandngan absorbansi 260/280.
3.3.2.1 Elektroforesis pada Gel Agarosa
Dibuat
gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 1 gr. Dan dilarutkan dalam buffer
TAE 1x dengan volume 20 ml. Didihkan larutan agarosa hingga bening. Disiapkan
baki gel agarosa dan dipasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel
agarosa. Dihomogenkan larutan kemudian dituang ke dalam baki gel agarosa dan
dibiarka hingga memadat. Diambil sisir dengan hati-hati. Dimasukkan baki yang
telah berisi gel agarosa ke dalam tangkai elektroforesis yang telah diisi
dengan larutan TBA hinnga gel terendam. Disiapkan sekitar 5 cm kertas paraflim.
Dimasukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye ke dalam sumur gel dengan cara
mencapurkan kedua bahan tersebut terlebih dhulu secara merata pada kertas
paraflim menggunakan mikropipet. Dibuat catatan nomor sumuran dan jenis sampel
DNA yang dimasukkan. Direndam gel agarosa yang telah diisi DNA dalam larutan
Etidium bromide selama 1 menit. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangkai
elektroforesis. Diatur voltase dan waktu running hingga angka 80 volt selama 40
menit dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. Elektroforesis akan
berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis. Direndam di dalam etidium
bromid selaqm 10 menit. Diletakkan gel di atas UV transminator dan nyalakan
UV-nya. Diamati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
3.3.2.2.
Nanofotometer
DNA
total yang telah diperoleh diuji dengan menggunakan nanofotometer untuk melihat
konsentrasasi dan kemurnian DNA sampel. Kalibrasi nanofotometer dilakukan
terlebih dahulu untuk setiap pengukuran DNA sampel. Sebanyak 2 µl aquades
diteteskan diatas kuvet nanofotometer. lid
diletakkan diatas kuvet dan ditekan tombol blank
untuk kalibrasi. Sebanyak 1 µl DNA sampel diteteskan diatas kuvet nanofotometer,
lid diletakkan diatas kuvet dan
ditekan tombol sampel. Konsentrasi DNA
diukur pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian DNA sampel diukur
dengan membagi nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dengn 280 nm. nilai
kisaran kemurnian DNA adalah 1,8 -2,0
pita ganda DNA dapat menyerap cahaya pada 260 nm. Sedangkan kontaminan protein
atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm.
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tabel
Hasil Isolasi DNA Genom Pada Tumbuhan
No
|
Nama Buah
|
Ulangan
|
Perlakuan Detergen
|
Hasil Pengamatan
|
||
Warna
|
Bentuk
|
Waktu
|
||||
1
|
Fragaria
vesca
(Strawberry)
|
1
|
Bubuk
|
Ungu Kehitaman
|
Lendir
|
1 menit
|
2
|
Ungu Kehitaman
|
Lendir
|
1 menit
|
|||
2
|
Manilkara
zapota
(Sawo)
|
1
|
Bubuk
|
Kuning Cerah
|
Lendir
|
12 detik
|
2
|
Kuning Cerah
|
Lendir
|
12 detik
|
|||
3
|
Hylocereus
polyrhzus
(Buah Naga)
|
1
|
Bubuk
|
Coklat Kehitaman
|
Lendir
|
53 detik
|
2
|
Coklat Kehitaman
|
Lendir
|
54 detik
|
|||
4
|
Actinidia
delliciosa
(Buah Kiwi)
|
1
|
Bubuk
|
Kuning Pucat
|
Berlendir Bulat
|
8 menit
|
2
|
Kuning
|
Berlendir Menyatu
|
11 menit
|
|||
5
|
Vitis
vinifera (Anggur)
|
1
|
Bubuk
|
Hijau Kehitaman
|
Benang Halus
|
1 menit
|
2
|
Hijau Kehitaman
|
Benang Halus
|
30 detik
|
|||
6
|
Ananas comosus
(Nenas)
|
1
|
Cair
|
Putih
|
Lendir
|
9 detik
|
2
|
Putih
|
Lendir
|
1 menit 9 detik
|
|||
7
|
Annona
muricata (Sirsak)
|
1
|
Cair
|
Putih
|
Butiran Pasir
|
28 detik
|
2
|
Putih
|
Butiran Pasir
|
19 detik
|
|||
8
|
Dimocarpus
longan
(kelengkeng)
|
1
|
Cair
|
Bening
|
Cair
|
6 detik
|
2
|
Bening
|
Cair
|
4 detik
|
|||
9
|
Citrullus
vulgaris
(semangka)
|
1
|
Cair
|
Kekuningan
|
Lendir
|
10 detik
|
2
|
Kekuningan
|
Lendir
|
10 detik
|
|||
10
|
Carica
papaya (pepaya)
|
1
|
Cair
|
Benang
|
Bening
|
1 menit 3 detik
|
2
|
Benang
|
Bening
|
3 menit 8 detik
|
|||
Dari Tabel 4.1 didapatkan
data dari proses isolasi DNA genom tumbuhan yang dilakukan dari beberapa sampel
yang diberi perlakuan detergen bubuk dan cair terdapat beberapa perubahan baik
dari warna, bentuk, dan waktu terjadinya
pembentukan yang diduga mengandung DNA. Perlakuan yang berbeda yang
diberikan pada setiap sampel memiliki pengaruh interval waktu untuk membentuk
struktur yang diduga DNA seperti terlihat adanya benang benang halus, gumpalan, dan lendir.
Dari semua sampel yang diisolasi
benang-benang halus yang diduga DNA, terbentuk pada interval waktu 0-11
menit dalam waktu tercepat pada perlakuan Dimocarpus longan, sementara waktu paling lama
untuk membentuk struktur DNA terdapat pada perlakuan Actinidia delliciosa. Bagian yang diduga DNA seperti benang
benang halus, gumpalan, dan lendir
inilah yang selanjutnya akan digunakan pada uji kualitatif DNA dengan
menggunakan elektroforesis.
Menurut Pandey
and Tamta (2015),
isolasi DNA genomik massa-massa-tinggi murni sangat penting untuk banyak
aplikasi biologi molekuler. Ada sejumlah protokol yang tersedia untuk ekstraksi
DNA dari bahan tanaman, tetapi sering sulit di banyak tanaman karena adanya
metabolit yang mengganggu prosedur isolasi DNA dan aplikasi berikutnya.
Ekstraksi DNA umumnya terhalang oleh polifenol dan produk oksidasi quinone yang
terkandung didalamnya dan oleh polimer karbohidrat, isolasi DNA menggunakan
kompleks CTAB memberikan produk kemurnian yang tidak memadai. Untuk studi
molekuler isolasi DNA berkualitas baik adalah prasyarat. Namun karena kandungan
fenolik yang tinggi, tanin dan polisakarida dalam jaringan daun Quercus, sangat
sulit untuk mengisolasi DNA kualitas baik bebas dari fenol, lignin dan pigmen
dengan metode konvensional. Metabolit ini tidak dapat dihilangkan selama isolasi
DNA.
Menurut Lee et al.,
(2011), elektroforesis
gel terdiri dari banyak molekul yang terbagi menjadi banyak fragmen oleh aksi
spesifik enzim. Fragmen ini tersebar di media polyacrylamide atau agarose gel
yang merupakan medan listrik diterapkan. Fragmen ini tersebar di media polyacrylamide atau agarose gel yang
merupakan medan listrik diterapkan. Setiap fragmen memiliki muatan listrik yang
berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka menempati tingkat yang berbeda
melalui gel. Setelah jangka waktu tertentu, proses terganggu dan gel bernoda
sehingga menjadi mungkin untuk mengamati di mana molekul berhenti. Setiap garis
dalam pola disebut band. Sekumpulan
dari Band yang dihasilkan oleh satu
sampel disebut lane. Dalam
menganalisis DNA suatu sampel dapat ditemukan pola genetik serupa, yang dapat
memberikan dukungan kepada pencantuman individu. Sekumpulan dari Band yang dihasilkan oleh satu sampel
disebut lane. Dalam menganalisis DNA
suatu sampel dapat ditemukan pola genetik serupa, yang dapat memberikan dukungan kepada pencantuman
individu.
4.2 Uji Kulitatif Dan Kuantitatif DNA
4.2.1 Uji Kualitatif DNA Elektroforesis
Keterangan :
M :Marker 11 :Ananas comosus
U1
1 :Fragaria vesca U1 12 :Ananas
comosus U2
2 :Fragaria vesca U2 13 :Annona
muricata U1
3 :Manilkara zapota U1 14 :Annona
muricata U2
4 :Manilkara zapota U2 15
:Dimocarpus longan U1
5 :Hylocereus polirhyzus U1 16 :Dimocarpus
longan U2
6 :Hylocereus polyrhyzus U2 17 :Citrullus
vulgaris U1
7 :Actinidia delliciosa U1 18 :Citrullus
vulgaris U2
8 :Actinidia delliciosa U2 19 :Carica
papaya U1
9 :Vitis vinifera U1 20 :Carica
papaya U2
10 :Vitis vinifera U2
Dari Tabel 4.2.1 dapat dilihat bahwa
data dari hasil elektroforesis setiap pita-pita DNA tersebut memperlihatkan
beberapa dari sampel terlihat pita-pita DNA yang jelas pada sumur baik pada
perlakuan detergen cair maupun detergen bubuk. Uji Kualitatif DNA dengan elektroforesis dari setiap sampel yang telah
berhasil diisolasi menunjukkan adanya beberapa pita DNA jelas/tebal dan pita
DNA yang tipis. Akan tetapi pada sebagian sumur tidak terlihat adanya pita DNA
jika divisualisasikan diatas sinar UV.
Menurut Campbell dkk (2008), setiap sampel campuran molekul-molukul DNA, ditempatkan
dalam sumur terpisah di dekat salah satu ujung petak gel yang tipis. Gel ini
dipasang dalam penyokong plastik kecil dan direndam dalam larutan berbasis air
dalam baki dengan elektroda pada kedua ujungnya. Ketika arus dinyalakan,
molekul DNA yanbg bermuatan negatif bergerak ke arah elektroda positif, dengan
molekul yang lebih pendek bergerak lebih cepat dari pada molekul panjang. Pita
yang ditunjukkan disini berwarna biru, namun pada gel sungguhan, pita itu belum
terlihat saat ini. Setelah arus dimatikan,pewarna yang mengikat DNA
ditambahkan. Pewarna ini berpendar merah muda dalam sinar ultra violet
meengungkapkan pita-pita terpisah yang berikatan dengan pewarna tersebut. Pada
gel di pita merah mua berkesesuaian dengan fragmen-fragmen DNA yang panjangnya
berbeda yang dipisahkan oleh elektroforesis. Analisis fragmen juga berguna unuk membandingkan dua
molekul DNA yang berbeda misalnya, dua alel dari sebuah gen. Situs itu akan
menghasilkan campuran yang berbeda berupa fragmen-fragmen dari masing-masing.
Setiap campuran akan menghasilkan pola pita sendiri dalam elektroforesis gel.
Menurut Fuad et al., (2016), secara
umum sampel makromolekul dielektroforesis melalui beberapa jenis media. Media
bertindak sebagai saringan molekuler untuk membantu dalam pemisahan molekul
berdasarkan ukuran. Jenis media pendukung yang digunakan tergantung pada jenis
molekul yang akan dipisahkan dan pemisahan berdasarkan muatan, berat molekul
atau keduanya. Bahan yang biasa digunakan untuk pemisahan asam nukleat dan
protein yaitu agarosa dan akrilamida. Larutan buffer sebagai elektrolit dalam
elektroforesis gel sangat mempengaruhi hasil migrasi molekul pada sampel.
Larutan elektrolit yang digunakan adalah buffer fosfat, komposisi buffer fosfat
yang digunakan antara lain : NaOH + H3PO4; KOH + H3PO4; dan NaH2PO4.H2O +
Na2HPO4. Ketika komposisi buffer terdapat basa kuat yaitu : NaOH + H3PO4; KOH +
H3PO4, suhu pada sistem sangat tinggi, sehingga menyebabkan media agar pada
elektroforesis gel rusak. Larutan buffer sebagai elektrolit pada elektroforesis
gel mempengaruhi migrasi molekul zat warna remazol. Larutan bufer berperan
sebagai media pendukung yang dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena
ion pembawanya bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan
meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal, dan dapat
mempercepat gerakan molekul pada sampel. Konduktivitas larutan buffer sangat
mempengaruhi hasil elektroforesis. Konduktivitas larutan merupakan kemampuan
suatu larutan dalam menghantarkan arus listrik. Pada larutan kemampuan ini dilakukan
oleh kation dan anion. Konduktivitas larutan bergantung pada jumlah ion yang
ada di dalam larutan.
4.2.2 Uji Kuantitatif DNA Nanofotometer
No.
|
Nama Buah
(Bahasa Latin)
|
kemurnian
|
Konsentrasi
|
||
U1
|
U2
|
U1
|
U2
|
||
1
|
Fragaria vesca
|
1,338
|
1,463
|
4,950
|
7,250
|
2
|
Manilkara zapota
|
2,150
|
1,462
|
4,300
|
9,200
|
3
|
Hylocereus polyrhizus
|
1,230
|
2,582
|
0,800
|
7,100
|
4
|
Actinidia delliciosa
|
1,529
|
0,750
|
12,09
|
0,150
|
5
|
Vitis vinifera
|
1,602
|
1,609
|
7,050
|
7,000
|
6
|
Ananas comosus
|
1,313
|
1,182
|
19,80
|
0,650
|
7
|
Annona muricata
|
1,714
|
1,348
|
1,800
|
1,550
|
8
|
Dimocarpus longan
|
1,850
|
1,648
|
2,46
|
7,300
|
9
|
Citrullus vulgaris
|
1,660
|
1,674
|
1,512
|
33,4
|
10
|
Carica papaya
|
1,531
|
1,386
|
9,950
|
3,950
|
Dari Tabel 4.2.2 di atas
didapatkan nilai dari hasil kemurnian dan konsentrasi masing masing sampel pada
uji kuantitatif DNA nanofotometer kemurnian
tertinggi yakni pada sampel Hylocereus
polyrhizus pada ulangan 1 yakni 2,582 dengan konsentrasi 7,100 .Sedangkan kemurnian
terendah pada sampel Actinida deliciosa dengan
konsentrasi 0,750. Secara teoritis sampel DNA yang dianggap murni memiliki
perbandingan A260/A280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian terendah dimungkinkan
terdapat kontaminasi fenol.
Menurut Iqbal (2016), menyatakan bahwa kuantitas DNA yang telah diisolasi dapat
diuji secara kuantitatif dengan spektofotometer. Prinsip pengukuran jumlah DNA
menggunakan spektofotometer didasarkan bahwa radiasi sinar ultra violet (UV)
diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV
secara maksimal oleh secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang
260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang
gelombang 280 nm hal ini menunjukkan konsentrasi dan kemurnian isolasi DNA
genom sampel uji.
Menurut Himesh (2011), menyatakan bahwa sampel DNA yang tervisualisasikan sebagai pita yang terang dan memiliki konsentrasi dan tingkat kemurnian tinggi. Pita DNA yang ringan dan terang tersebut pada penelitian ini juga memiliki konsentrasi dan tingkat kemurnian yang tinggi. Pita
DNA yang ringan dan terang tersebut pada penelitian ini juga memiliki konsentrasi dan tingkat kemurnian yang tinggi. 2 pita DNA di bawah pita yang
terang dan terang pita DNA tersebut. Dua pita ini terbentuk karena DNA hasil isolasi setelah fragmentasi. Fragmentasi dapat terjadi selama proses ekstraksi, DNA terpotong-potong menyebabkan terbentuknya beberapa pita DNA kompilasi dielektroforesis.
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan daripraktikum ini adalah :
a.
Tahapan dalam isolasi DNA
yaitu perlakuan untuk membuka sel dan melepaskan DNA kemudian metode untuk
menghilangkan atau menonaktifkan enzim yang dapat mendegradasi DNA serta
perlakuan yang dapat memisahkan DNA dari molekul kontaminan yang lain. Prinsip
isolasi DNA yaitu penghancuran atau pemecahan secara fisik dengan penggerusan,
pemecahan dinding sel, dan pemisahan DNA dari bahan yang lain.
b.
Cara membuat gel agarosa
adalah dibuat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 1 gr. Dilarutkan
dalam buffer TAE 1x dengan volume 100 ml.
Didihkan larutan agarosa hingga bening. Disiapkan baki gel agarosa dan dipasang
sisir elektroforesis disalah satu ujung baki gel agarosa. Dihomogenkan larutan
kemudian dituang kedalam baki gel agarosa dan dibiarkan hingga memadat.
c.
Cara mendeteksi DNA pada gel
agarosa adalah dengan elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa
adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk.
Teknik ini sederhana, cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran potongan
DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat dibandingkan dengan densitas gradient
sentrifugasi.
5.2.
Saran
Adapun saran dari praktikum
ini adalah:
a. Sebaiknya
praktikan lebih baik dan bersih dalam melakukan proses penghalusan ekstrak
sampel.
b. Sebaiknya
praktikan lebih berhati-hati saat meletakkan ekstrak sampel di dalam sumur
elektroforesis.
c. Sebaiknya praktikan lebih baik lagi dalam
pengambilan reagen dan penimbangan sampel buah.
DAFTAR PUSTAKA
Alatas
Z, 2006. Efek Pewarisan Akibat Radiasi Pengion.
Jurnal Iptek Ilmiah Populer. 8(2):65-74.
Campbell NA, Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA,
Minorsky PV, Jackson RB. 2008. BIOLOGI Edisi Kedelapan Jilid Satu. Erlangga.
Jakarta. Page: 436-439.
Croy RRD,
1993. Plant Moleculer Biology. Academic
Press. USA. Page: 21. Jurnal Ilmu Tanah dan Agroklimatologi. 7(1):51-58.
Doolan DL, 2002. Malaria
Methods and Protocols. Humana Press. USA. Page: 159.
Fuad ARM, Ulfin I, Kurniawan F, 2016. Penggunaan
Agar-agar Komersial sebagai Media Gel Elektroforesis Pada Zat Warna Remazol:
Pengaruh Komposisi Buffer, pH Buffer dan Konsentrasi Media. Jurnal Sains dan Seni Its. 52: 130-133.
Halpin
DR and Harbury PB, 2004.DNA Display I. Sequence-Encoded Routing of DNA
Populations.PLoS Biology. 72:
1015-1021.
Herrmann B and Hummel S, 1994.Ancient DNA:
Recovery and Analysis of Genetic Material from Paleontological. New York:
Spinger-Verlag. Page 67.
Himesh S, Singhai AK, Priyanka S, Sarvest
S, Kumar V,2011. Spectrophotometric
Method For Quantitaive Estimation Of DNA Isolated. Internasionali
research journal of pharmasi. 2(12):169171
Julyasih SM,
2004. Deteksi patogen penyebab penyakit CVPD. Jurnal pertanian mapeta. 7(1):7-11
Igbal M, 2016.
Analisis perbandingan metode isolasi DNA. Jurnal
perikanan kelautan. 7(1):54-65
Jiann-Der Lee
JD, Huang CH, Wang1 NW, Lu CS, 2011.
Automatic DNA sequencing for
electrophoresis gels using image processing algorithms. J. Biomedical Science
and Engineering. 41: 523-528.
Lini
S, 2008. Kelainan Jumlah Kromosom 21 Pada Ibu Hamil Terhadap Janin Yang ada di Kandungannya. Jurnal Kesehatan. (1)1:
18-25.
Palupi N, 2015. Proses Mitosisi Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa L.) Pasca Iradiasi
Sinar Gamma. Skripsi Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN
Sunan Kalijaga. Hal:15-22.
Pandey A and Tamta
S, 2015.High-molecular-weight DNA extraction from six Quercus species of
Kumaun Himalaya, India.International Journal of
Advanced Research (2015), Volume 3, Issue 7, 30-34.
Sarasmiyarti A, 2008. Analisis Sittogenetika Tanaman
Manggis (Garsinia mangostana L.)
Jogorogo. Sripsi Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. Hal:1-25.
Stefunova1
v, Lancíkova, Bežo M, 2013. The effect of DNA isolation and its applicability
in the the PCR analysis of Lettuce (Lactuca sativa L.). Acta fytotechn. 41: 99–102.
Good
BalasHapus