CONTOH JURNAL GENETIKA ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS

ISOLASI DNA GENOM TUMBUHAN

PEPAYA (Carica papaya)

DAN ELEKTROPORESIS DENGAN SEL AGAROSA

Disusun Oleh:

Partner 5B

NAMA                            NIM

       Edi Susanto                    160805057

LABORATORIUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHU ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARAMEDAN

MEDAN

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1   Latar Belakang

Indonesia merupakan negara agraris dan pernah menjadi negara swasembada pada tahun 1998. Peningkatan jumlah penduduk yang sangat drastis tiap tahunnya menjadi permasalahan dalam masyarakat, seperti peningkatan jumlah kebutuhan pangan,papan dan sandang. Tata kota pun telah mengubah fungsi lahan-lahan menjadi fungsi yang lain, misalnya perubahan gaya hidup telah mengalihfungsikan lahan-lahan produktif tanaman pertanian menjadi pemukiman, industri, pariwisata, tempat usaha bahkan sarana transfortasi. Hal ini jelas akan mengurangi produksi tanaman (Arianti, 2010).

            DNA menyimpan informasi penting tentang struktur hewan atau tumbuhan, dan membantu langsung organism seperti tumbuh dan mengelola tugas-tugas sehari-hari. Kromosom berfungsi sebagai penyimpanan untuk bahan penting ini, secara berkala membagi bersama dengan sel dan mereplikasi untuk membuat salinan DNA yang dikandungnya. Kromosom juga sangat penting dalam reproduksi seksual, karena mereka  memungkinkan organisme untuk menyampaikan materi genetik pada keturunan. Dalam organisme dengan inti sel, yang dikenal sebagai eukariotik, kromosom ditemukan dalam nukleus. Sebagian besar organism memiliki satu sel Kromosom juga sangat penting dalam reproduksi seksual, karena mereka  memungkinkan organisme untuk menyampaikan materi genetik pada keturunan. Dalam organisme dengan inti sel, yang dikenal sebagai eukariotik, kromosom ditemukan dalam nukleus. Sebagian besar organisme memiliki satu sel kromosom yang dating berpasangan. Pada sel struktural, setiap sel mempertahankan satu sel lengkap kromosom, dalam apa yang dikenal sebagai bentuk diploid, mengacu pada fakta bahwa sel kromosom lengkap. Proses kehidupan merupakan suatu proses metabolisme yang berlangsung di dalam sel. Penentuan sifat organisme dilakukan oleh gen melalui pengendalian proses metabolisme dengan cara mengatur reaksi-reaksi kimia yang menyusun suatu lintasan metabolisme. Proses metabolisme merupakan rangkaian dari jutaan reaksi kimia (Lini, 2008).

1.2  Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini adalah:

a.       Mengetahui tahapan dan prinsip isolasi DNA genom dari tumbuhan secara sederhana.

b.      Mengetahui cara membuat gel agarose.

c.       Mendeteksi DNA pada gel agarose.

1.3  Manfaat Praktikum

Manfaat dari praktikum ini adalah:

a.       Dapat mengetahui tahapan dan prinsip isolasi DNA genom dari tumbuhan secara sederhana.

b.      Dapat Mengetahui cara membuat gel agarose.

c.       Dapat Mendeteksi DNA pada gel agarose.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNA

Kromosom manusia yang berjumlah 23 pasang, mengandung ribuan gen yang merupakan rantai pendek dari DNA yang membawa kode informasi tertentu dan spesifik untuk satu macam polipeptida yang harus disintesa oleh sel. Genom manusia merupakan susunan dari DNA pada semua kromosom dengan panjang total (haploid) sekitar 3 juta kb (3.000 Mb). Pada 46 buah kromosom, jumlah pasangan basa pada sekitar 6 x 109 pasangan basa DNA. Perkiraan terakhir jumlah gen pada manusia berdasarkan pada Human Genome Sequences yang dikeluarkan oleh Celera Genomics dan Human Genome Project (2001) adalah sekitar 26.000 - 40.000. Jumlah DNA bervariasi dari satu kromosom ke kromosom yang lain. Paling panjang adalah kromosom dengan jumlah sekitar 263 Mb dan paling pendek adalah kromsom no. 21 sekitar 50 Mb. Genom berpotensi mengalami mutasi yaitu perubahan pada kromosom, gen dan DNA. DNA merupakan sepasang rantai/untai panjang polinukliotida berbentuk spiral ganda (double helix) yang dihubungkan dengan ikatan hydrogen dan berdiameter sekitar 2nm. Sebuah nukliotida tersusun dari molekul gula, basa dan gugus fosfat. Empat jenis basa nitrogen yang terikat pada molekul  gula dan saling berpasangan adalaha denin (A) dengan timin (T) melalaui ikatan ganda hidrogen, dan guanin (G) dengan sitosin (C) melalui ikatan tiga hidrogen. Dengan adanya ikatan antara dua untai polinukliotida ini, maka tiap untai DNA adalah komplementer dengan untai DNA lainnya (Alatas, 2006).

2.3 Fungsi DNA

Analisis sitogenetika khusus sifat-sifat morfologi kromosom (bentuk dan ukuran) dapat menghasilkan informasi susunan kromosom (kariotipe). Informasi genetik ini berguna untuk pengembangan tanaman khususnya berkaitan dengan kegiatan pemuliaan tanaman baik penerapan secara langsung maupun tidak. Penggunaan informasi genetik  dalam pemuliaan tanaman secara tidak langsung yaitu berupa peningkatan pengetahuan susunan genetik suatu jenis tanaman dan secara langsung berupa penerapan teknik sitogenetika untuk perbaikan sifat tanaman. Terdapat tanaman yang memiliki kekhasan tersendiri. Kekhasan buah terdapat pada warna buah, ukuran, rasa yang manis segar. Informasi genetika tanaman belum banyak diketahui. Informasi genetika berkaitan erat dengan kromosom sebagai komponen pembawa sifat genetik. Informasi tenang sifat-sifat morfologi kromosom (bentuk dan ukuran) dan susunan kromosom (kariotipe) tanaman (Sarasmiyarti, 2008).

Fungsi DNA dalam intisel adalah untuk mengendalikan faktor-faktor keturunan (proses pewarisan) dan sintesa protein yang terkait dengan peranan penting nya dalam mengatur aktivitas sel. Sebagai pembawa informasi genetik, DNA berperan dalam penyimpanan, replikasi, rekombinasi dan penghantaran informasi genetik. Dalam setiap molekul DNA urutan nukleotida sudah baku karena urutan ini merupakan isyarat bagi normalnya informasi genetik. Urutan dari pasangan basa pada untai DNA mengandung informasi genetik dalam bentuk kode yang menyandi sejumlah besar protein yang ada dalam sel (Alatas, 2006).

2.4 Kerusakan DNA

Paparan radiasi dapat menimbulkan kerusakan baik pada tingkat molekuler, seluler ataupun jaringan/organ. Dosis radiasi harus mencapai tingkat ambang tertentu untuk dapat menimbulkan kerusakan akut, tetapi tidak sama halnya dengan kerusakan geneik atau induksi kanker. Secara teori, dosis radiasi sangat rendah sudah cukup untuk menimbulkan kerusakan, berarti bahwa tidak ada tingkat dosis yang berbahaya secara homogen. Bahkan pada dosis yang relatif lebih tinggibtidak tidak setiap orang mengalami tingkat kerusakan yang karena adanya perbedaan tingkat kemampuan dan ketepatan mekanisme perbaikan terhadap kerusakan yang timbul akibat radiasi. Mutasi yang terjadi secara alamiah ataupun spontan pasa sel somatik dan germinal masing-masing memberikan konribusi pada induksi kanker danpenyaki genetik  yang diwariskan (yaitu penyakit herediter). Kerusakan yang terjadi dapat diperbaiki tanpa kesalahan sehingga struktur DNA kembali seperti semula dan tidak menimbulkan perubahan fungsi pada sel. Tetapi dalam kondisi tertentu, proses perbaikan tidak berjalan sebagaimana mestinya sehingga walaupun kerusakan dapat diperbaiki tetapi tidak tepat ataupun sempurna sehingga menghasilkan DNA dengan struktur yang berbeda, yang dikenal dengan mutasi. Kerusakan yang terjadi pada sebuah sel somatik yang tidak dapat mengalami proses perbaikan secara benar dan tepat maka akan terjadi mutasi somatik. Tetapi bila kerusakan terjadi pada sel telur atau sel sperma, maka akan terjadi mutasi genetik. Sebuah mutasi genetik berpotensi untuk menimbulkan perubahan yang dapat diamati pada generasi berikutnya (Alatas, 2006).

            Pada dekade terakhir telah  dijumpai banyaknya penemuan tentang penggunaan radiasi khususnya sinar gamma, untuk evolusi varietas unggul tanaman pertanian dalam bidang ekonomi. Misalnya dalam usaha pemuliaan tanaman dengan induksi mutasi dengan mengguanakan iradiasi sinar gamma. Induksi iradiasi dengan sinar gamma memberikan pengaruh yang berbeda antara tanaman. Perbedaan tersebut dipengaruhi oleh tingkat radiosensitifitas masing-masing tanaman selain perbedaan tingkat radiosensitifitas, pengaruh iradiasi pada suatu jenis tanamn juga tergantung pada tingginya dosis iradiasi yang diberikan. Dosis iradiasi pada tanaman menyebabkan terganggunya kesimbangan hormon dan aktifitas enzim pada tanaman. Sinar gamma menyebabkan adanya bentuk-bentuk mutasi pada tanaman kacang panjang (cowpea), kacang hijau (mungbean) dan tanaman kunyit (curcuma) yang terlihat dan di kelompokkan pada tinggi tanaman, modifikasi atau abnormalitas daun, variasi cabang, mutasi pada bunga, polong dan biji. Iradiasi sinar gamma menyebabkan kelainan pada tahap – tahap pembelahan mitosis. Salah satu penyebab terjadinya perubahan fenotip adalah adanya kelainan pada saat pembelahan sel baik pada saat mitosis maupun meosis. Pada saat pembelahan sel kromosom sangat sensitif terhadap mutagen, sehingga akan mudah mengalami kerusakan, kromosom alan lebih sensitif pada tahap profase saat pembelahan mitosis  (Palupi, 2015).

2.4 Isolasi DNA

Isolasi DNA genomik berkualitas tinggi sering merupakan langkah awal untuk analisis genetika molekuler dan sangat penting untuk banyak aplikasi dalam penelitian molekuler. Kriteria untuk kualitas DNA adalah kemurnian, stabilitas dan integritas dan ukuran molekul.kuantitas juga sering merupakan masalah penting, terutama untuk materi dengan sumber daya terbatas. mungkin ada banyak protokol dan teknik isolasi DNA yang tersedia. namun hanya beberapa protokol yang memenuhi kriteria yang disebutkan di atas, meskipun umumnya mereka bekerja berdasarkan prinsip yang sama. kit isolasi DNA komersial umum sangat tersedia, mengubur DNA pada matriks afinitas. kit ini mahal dan sulit untuk beradaptasi dengan berbagai jumlah bahan awal, tetapi memungkinkan standarisasi lengkap, keluaran tinggi dan otomatisasi. protokol yang dijelaskan dalam bab ini memungkinkan isolasi DNA dengan kualitas dan kemurnian yang sangat tinggi dalam waktu yang wajar dan tanpa menggunakan bahan yang mahal atau langka. Protocol dapat dengan mudah diadaptasi untuk aplikasi berskala besar dan menghasilkan DNA berkualitas baik bahkan dengan sejumlah kecil bahan sampel dengan sedikit atau tanpa kontaminan protein (Doolan, 2002).

            Ada banyak kesulitan yang terkait dengan isolasi asam nukleat tanaman yang tidak terdegradasi yang bebas dari kontaminasi protein dan polisakarida. Metode ekstraksi yang berbeda diperlukan karena kelompok tanaman yang berbeda diperlukan karena kelompok tanaman yang berbeda mengandung beragam senyawa sekunder yang dapat mengganggu isolasi. Titik eksperimental utama yang paling banyak disetujui oleh referensi adalah kebanyakan sel tumbuhan memilki dinding sel yang sangat keras, oleh karena itu metode yang kuat diperlukan untuk menghancurkan sel-sel yang terbuka. Efisiensi dari kekuatan fisik yang diberikan pada jaringan sangat penting (Croy, 1993).

2.5 Proses RADP

       Tahapan dalam proses analisis keragaman genetik menggunakan RAPD yaitu isolasi DNA genom, pemurnian dan penetapan kualitas dan kuantias DNA, seleksi primer, dan analisis polimorfisme. Permasalahan yang umum ditemui dalam proses isolasi DNA tanaman adalah degredasi DNA oleh enzim endonukleasse, tingginya kandungan polisakarida, ssenyawa inhibitor seperti polofenol dan metabolik skunder lain yang dapat mengganggu reaksi enzimatik tingkat pemurnian DNA hasil isolasi juga menjadi salah ssatu faktor penentu keberhasilan proases amplifikasi DNA menggunakan primer acak seperti analisis RAPD. Protokol isolasi DNA tanaman dan amplifikasi menggunakan primer acak telah banyak dikembangkan, namun tidak setiap prosedur dapat di a[likassikan pada setiap spesies tanaman sekalipun memiliki hubungan kekerabtan yang dekat atau jenis yang sama (Setyowati, 2013).

2.6 Elektroforesis

Banyak pendekatan yang digunakan untuk mempelajari molekul-molekul DNA melibatkan elektroforesis gel (gel electrophoresis). Teknik ini menggunakan gel dari polimer, misalnya polisakarida. Gel bekerja sebagai penapis molekul untuk memisahkan asam nukleat atau protein berdasarkan ukuran, muatan listrik dan sifat-sifat lain. Karena mengandung muatan negatif pada gugus-gugus fosfatnya, molekul asam nukleat bergerak ke arah kutup positif dalam medan listrik. Saat bergerak kisi-kisi serat polimer menjadikan molekul panjang lebih sulit bergerakdari pada molekul pendek, sehingga molekul-molekul terpisah berdasarkan panjang. Dengan demikian, elektroforesis gel memisahkan campuran molekul DNA lurus menjadi pita-pita, yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul DNA yang panjangnya sama. Satu lagi aplikasi yang bermanfaat dari teknik ini adalah analisis fragmen restriksi (restriction fragment analysis), yang dapat dengan cepat menyediakan informasi berguna tentang skuens DNA. Dalam tipe analisis ini, fragmen DNA yang dihasilkan melalui digesti molekul DNA oleh enzim restriksi (pemotong) dipilah-pilah dengan elektroforesis gel. Ketika campuran fragmen restriksi menjalani elektroforesis, campuran itu menghasilkan pola pita yang khas untuk molekul awal dan enzim restriksi yang digunakan (Campbell dkk, 2008).

2.7 Elekroforasi

Dalam elektroforasi (electroporation), sengatan listrik sejenak yang diberikan pada larutan yang mengandung sel akan menciptakan lubang-lubang sementara pada membran plasma sel, yang dapat dilewatti DNA saat memasuki sel. Kemungkinan yang lain, ilmuan dapat menyuntikkan DNA secara langsung ke dalam sel-sel eukariot tunggal dengan menggunakan jarum berukuran microskopik. Untuk memasukkan DNA ke dalam sel tumbuhan. Apabila DNA             yang diintroduksikan digabungkan ke dalam genom sel melalui rekombinasi genetik, maka DNA itu dapat diekspresikan oleh sel. Elektoforesis gel digunakan untuk memisahkan asam nukleat atau protein yang memiliki bperbedaan ukuran, muatan listrik, atau sifat-sifat fisik yang lain. Molekul DNA dipisahkan oleh elektroforesis gel dalam analisis fragmen restriksi kedua gen hassil klona dan DNA genom (Campbell dkk, 2008).

BAB 3

BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Isolasi DNA Genom Tumbuhan dan Elektroforesis dengan Gel Agarosa dilaksanakan pada hari Rabu 04 April 2018 dan Jum’at 13 April 2018, pada pukul 14:00 WIB sampai dengan selesai di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah beaker glass, pisau, pengaduk, spatula, tabung reaksi, mortal, pistil, pemanas, alat elektroforesis, erlenmeyer, gelas ukur, dan micropipet. Sedangkan bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah kertas saring, plastik klep, deterjen, akuades, garam dapur, etanol absolute, buah pepaya (Carica papaya), tip,  tub, dan gel doc.

3.3 Prosedur

3.3.1 Isolasi DNA Genom Tumbuhan

Larutkan deterjen dengan akuades 100 ml didalam beaker glass dan diaduk pelan selama 15 menit (jangan sampai berbusa). Selanjutnya ditambahkan 4 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh campuran yang homogen. Diambil 100 gram buah dan ditambah 20 ml akuades kemudian di hancurkan. Lalu diambil sampel yang telah dihancurkan sebanyak 20 ml, lalu campurkan kedalam 20 ml larutan ekstraksi, dipanaskan pada suhu 65^oC selama 10 menit. Saring campuran dan masukkan 5 ml kedalam tabung reaksi. Tambahkan 5 ml etanol dingin secara perlahan kedalam tabung reaksi. Kemudian amati perubahan yang terjadi (proses terbentuknya DNA yang meliputi warna, bentuk dan waktu). Setelah diamati dimasukkan DNA ditambah etanol dingin (Benang-benang DNA) kedalam tube secara perlahan (jangan sampai terputus). Lalu didiamkan selama semalaman. Selanjutnya di sentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, ditambah alcohol 70% , di sentrifuse kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Kemudian dikering anginkan dan ditambahkan ddH20, kemudian di larutkan.

3.3.2 Elektroforesis Pada Gel Agarosa

Buatlah gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0.2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Didihkan larutan agarosa hingga mendidih sempurna. Siapkanlah baki gel agarosa, pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan menyentuh dasar baki. Tempelkan erlenmeyer ke tangan untuk memeriksa suhu larutan agarosa, jika suhu telah turun sekitar 50-60 ⁰C, homogenkan sebentar. Tuangkanlah larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga memadat. Ambillah sisir dengan hati-hati, masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis byang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan gel terendam seluruhnya). Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. Dimasukkan 10 mikroliter sampel DNA dan 2 mikroliter loading bdye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan mencampurkan kedua bahan secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet, buatlah catatan nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan, hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis, aturlah voltase dan waktu running hingbga diperoleh angka 80 V dan 30 menit dengan cara menekan ombol yang sesuai pada sumber arus, jalankan elektroforesis dengan cara menekan tombol run pada sumber arus, elektroforesis akan berhenti bila waktu yang ditetapkan sudah habis. Keluarkan gel dan rendam dalam larutan ethidium 10 menit, kemudian 5 menit, letaqkkan gel diatas UV transluminator, nyalakan Uvnya. Amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

DAFTAR PUSTAKA

Alatas Z, 2006. Efek Pewarisan Akibat Radiasi Pengion. Jurnal Iptek Ilmiah Populer. 8(2):65-74.

Arianti e, Sutopo, Suwarto, 2010. Kajian Status Hara Makro Ca, Mg, dan S Tanah Sawah Kawasan Industri Daerah Kabupaten Karanganyar. Jurnal Ilmu Tanah dan Agroklimatologi. 7(1):51-58.

Campbell NA, Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB. 2008. BIOLOGI Edisi Kedelapan Jilid Satu. Erlangga. Jakarta. Page: 436-439.

Croy RRD, 1993. Plant Moleculer Biology. Academic Press. USA. Page: 21. Jurnal Ilmu Tanah dan Agroklimatologi. 7(1):51-58.

Doolan DL, 2002. Malaria Methods and Protocols. Humana Press. USA. Page: 159.

Lini S, 2008. Kelainan Jumlah Kromosom 21 Pada Ibu Hamil Terhadap Janin Yang ada di Kandungannya. Jurnal Kesehatan. ­(1)1: 18-25.

Palupi N, 2015. Proses Mitosisi Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa L.) Pasca Iradiasi Sinar Gamma. Skripsi Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Sunan Kalijaga. Hal:15-22.

Sarasmiyarti A, 2008. Analisis Sittogenetika Tanaman Manggis (Garsinia mangostana L.) Jogorogo. Sripsi Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. Hal:1-25.

Setyowati, N. 2013. Optimasi Isolasi DNA dan PCR-RAPD Pada Tanaman Garut (Maranta arundinaea L.) Lokal Dry. Uniersitas Negri Islam Sunan Kalijaga: Yogyakarta.